2×Pfu PCR Mix

Szablon A-1

■ Matryca zawiera zanieczyszczenia białkowe lub inhibitory Taq itp. ——Oczyść matrycę DNA, usuń zanieczyszczenia białkowe lub ekstrahuj matryce DNA za pomocą zestawów do oczyszczania.

■ Denaturacja szablonu nie jest kompletna —— Odpowiednio zwiększyć temperaturę denaturacji i przedłużyć czas denaturacji.

■ Degradacja szablonu — — Ponownie przygotuj szablon.

Podkład A-2

■ Słaba jakość starterów —— Ponownie zsyntetyzuj starter.

■ Degradacja primera —— Rozdzielić primery o wysokim stężeniu do małej objętości w celu konserwacji. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania lub długotrwałego kriokonserwacji w temperaturze 4°C.

■ Niewłaściwe zaprojektowanie starterów (np. niewystarczająca długość startera, dimer utworzony między starterami itp.) - Przeprojektowanie starterów (unikaj tworzenia dimeru startera i struktury drugorzędowej)

A-3 Mg²⁺stężenie

■ Mg²⁺ stężenie jest zbyt niskie ——Właściwie zwiększyć Mg²⁺ stężenie: Optymalizacja Mg²⁺ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg²⁺ stężenie dla każdej matrycy i startera.

A-4 Temperatura wyżarzania

■ Wysoka temperatura annealingu wpływa na wiązanie startera i matrycy. —— Zmniejsz temperaturę wyżarzania i zoptymalizuj warunki z gradientem 2°C.

A-5 Czas przedłużenia

■ Krótki czas przedłużenia——Wydłużenie czasu przedłużenia.

Zjawiska: Próbki ujemne również wykazują prążki sekwencji docelowej.

A-1 Zanieczyszczenie PCR

■ Zanieczyszczenie krzyżowe sekwencji docelowej lub produktów amplifikacji ——Uważaj, aby nie odpipetować próbki zawierającej sekwencję docelową w próbce ujemnej ani nie wylać jej z probówki wirówkowej. Odczynniki lub sprzęt powinny być autoklawowane w celu wyeliminowania istniejących kwasów nukleinowych, a zanieczyszczenie powinno być stwierdzone poprzez eksperymenty z kontrolą ujemną.

■ Zanieczyszczenie odczynnikiem —— Podziel odczynniki i przechowuj w niskiej temperaturze.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ stężenie jest zbyt niskie ——Właściwie zwiększyć Mg²⁺ stężenie: Optymalizacja Mg²⁺ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg²⁺ stężenie dla każdej matrycy i startera.

■ Niewłaściwy projekt startera i sekwencja docelowa ma homologię z sekwencją inną niż docelowa. —— Przeprojektuj podkłady.

Zjawiska: Prążki amplifikacji PCR są niezgodne z oczekiwaną wielkością, albo duże, albo małe, lub czasami występują zarówno specyficzne prążki amplifikacji, jak i nieswoiste prążki amplifikacji.

Podkład A-1

■ Słaba specyficzność startera

—— Przeprojektuj podkład.

■ Stężenie podkładu jest zbyt wysokie ——Właściwie zwiększ temperaturę denaturacji i przedłuż czas denaturacji.

A-2 Mg²⁺ stężenie

■ Mg²⁺ stężenie jest zbyt wysokie ——Właściwie zmniejsz stężenie Mg2+: Zoptymalizuj Mg²⁺ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg²⁺ stężenie dla każdej matrycy i startera.

A-3 Termostabilna polimeraza

■ Nadmierna ilość enzymu —— Odpowiednio zmniejsz ilość enzymu w odstępach 0,5 U.

A-4 Temperatura wyżarzania

■ Temperatura wyżarzania jest zbyt niska —— Odpowiednio zwiększyć temperaturę wyżarzania lub zastosować metodę wyżarzania dwuetapowego

A-5 cykli PCR

■ Za dużo cykli PCR —— Zmniejsz liczbę cykli PCR.

Podkład A-1——Słaba specyficzność ——Przeprojektuj starter, zmień położenie i długość startera, aby wzmocnić jego specyficzność; lub wykonaj zagnieżdżoną reakcję PCR.

A-2 Szablon DNA

—— Matryca nie jest czysta —— Oczyść matrycę lub wyodrębnij DNA za pomocą zestawów do oczyszczania.

A-3 Mg²⁺ stężenie

——Mg²⁺ stężenie jest zbyt wysokie ——Właściwie zmniejsz Mg²⁺ stężenie: Optymalizacja Mg²⁺ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg²⁺ stężenie dla każdej matrycy i startera.

A-4 dNTP

—— Stężenie dNTP jest zbyt wysokie —— Odpowiednio zmniejsz stężenie dNTP

A-5 Temperatura wyżarzania

——Zbyt niska temperatura wyżarzania ——Odpowiednio zwiększyć temperaturę wyżarzania

A-6 cykli

——Zbyt wiele cykli ——Zoptymalizuj liczbę cykli

Pierwszym krokiem jest wybór odpowiedniej polimerazy. Zwykła polimeraza Taq nie może dokonać korekty ze względu na brak aktywności 3'-5' egzonukleazy, a niedopasowanie znacznie zmniejszy wydajność wydłużania fragmentów. Dlatego zwykła polimeraza Taq nie może skutecznie amplifikować fragmentów docelowych większych niż 5 kb. Polimerazę Taq ze specjalną modyfikacją lub inną polimerazę o wysokiej wierności należy wybrać w celu poprawy wydajności wydłużania i zaspokojenia potrzeb amplifikacji długich fragmentów. Ponadto amplifikacja długich fragmentów wymaga również odpowiedniego dostosowania projektu startera, czasu denaturacji, czasu wydłużania, pH buforu itp. Zwykle startery o wielkości 18-24 pz mogą prowadzić do lepszej wydajności. Aby zapobiec uszkodzeniu matrycy, czas denaturacji w 94°C należy skrócić do 30 sekund lub mniej na cykl, a czas wzrostu temperatury do 94°C przed amplifikacją powinien być krótszy niż 1 min. Ponadto ustawienie temperatury wydłużania na około 68°C i zaprojektowanie czasu wydłużania na poziomie 1 kb/min może zapewnić skuteczną amplifikację długich fragmentów.

Wskaźnik błędu amplifikacji PCR można zmniejszyć, stosując różne polimerazy DNA o wysokiej wierności. Spośród wszystkich dotychczas znalezionych polimeraz DNA Taq, enzym Pfu ma najniższy wskaźnik błędów i najwyższą wierność (patrz załączona tabela). Oprócz selekcji enzymów, naukowcy mogą jeszcze bardziej zmniejszyć szybkość mutacji PCR poprzez optymalizację warunków reakcji, w tym optymalizację składu buforu, stężenia termostabilnej polimerazy i optymalizację liczby cykli PCR.