Zestaw do szybkiej ukierunkowanej mutagenezy

Szybka mutacja jednomiejscowa lub wielomiejscowa w genie docelowym w wektorze docelowym.

Mutageneza ukierunkowana in vitro jest ważną metodą eksperymentalną w różnych dziedzinach biologii i medycyny, wykorzystywaną głównie do modyfikacji i optymalizacji genów docelowych, badania miejsc regulacyjnych promotorów, a także badania złożonych relacji między strukturą a funkcją białek. Zestaw wykorzystuje obecnie wiodącą technologię do bezpośredniego przeprowadzania mutacji jednomiejscowej, mutacji wielomiejscowej, a także mutacji insercyjnej lub delecyjnej genu docelowego. Szybkość mutacji mutacji w jednym miejscu może osiągnąć ponad 90%. Ponadto, w przeciwieństwie do tradycyjnych zestawów do mutacji, które wymagają wielu rund PCR, subklonowania i innych czasochłonnych i pracochłonnych etapów, obsługa zestawu jest prostsza i do skonstruowania zmutowanego szczepu potrzebne są tylko cztery etapy.

Kot. Nie Wielkość opakowania
44992901 20 rxn

 

 


Szczegóły produktu

FAQ

Tagi produktów

Cechy

■ Prosty i szybki: zestaw wykorzystuje technologię amplifikacji plazmidu bez substytucji nici. Potrzeba tylko 4 kroków, aby przeprowadzić transformację ze szczepu typu dzikiego do szczepu zmutowanego, bez czasochłonnych i pracochłonnych etapów, takich jak wielokrotne rundy PCR i subklonowanie.
■ Starter o wysokiej wydajności: zestaw wykorzystuje zasadę projektu częściowo nakładającego się startera, dzięki czemu przez amplifikację można uzyskać więcej zmutowanych plazmidów.
■ Szerokie zastosowanie: zestaw może nie tylko przeprowadzić mutację jednomiejscową, ale także mutację wielomiejscową. Może zmutować do 5 witryn.
■ Silna adaptacyjność: zestaw może przeprowadzić ukierunkowaną mutację na plazmidach o maksymalnej wielkości 10 kb, obejmując zasadniczo wszystkie powszechnie stosowane plazmidy.
■ Wysoka szybkość mutacji: zestaw posiada funkcję podwójnego trawienia zmetylowanych matryc plazmidowych in vitro i in vivo, zapewniając wyższą szybkość mutacji.

Konfiguracja reakcji mutacji miejsca i program PCR

■ W przypadku mutacji w jednym starterze w wielu miejscach częstość mutacji będzie niższa niż w przypadku mutacji w jednym miejscu ze względu na zwiększoną liczbę miejsc mutacji. Według naszych danych eksperymentalnych, gdy liczba miejsc mutacji osiągnie 5, odsetek pozytywnych mutacji zostanie zmniejszony do 50%. Dlatego w tym przypadku zaleca się zwiększenie liczby zweryfikowanych klonów.
■ Zestaw obsługuje mutacje z wieloma starterami i wieloma miejscami, dzięki czemu eksperymenty z mutacjami mogą być przeprowadzane jednocześnie w szerszym zakresie genów. Górna granica liczby miejsc mutacji nadal wynosi 5.
■ Sugeruje się stosowanie plazmidów kontrolnych i starterów dostarczonych w zestawie podczas przeprowadzania nowych eksperymentów z mutacją, aby ułatwić analizę problemów doświadczalnych.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Wszystkie produkty można dostosować do potrzeb ODM/OEM. Dla szczegółów,kliknij opcję Dostosowana usługa (ODM/OEM)


  • Poprzedni:
  • Następny:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    P: Brak pasm wzmacniających

    Szablon A-1

    ■ Matryca zawiera zanieczyszczenia białkowe lub inhibitory Taq itp. ——Oczyść matrycę DNA, usuń zanieczyszczenia białkowe lub ekstrahuj matryce DNA za pomocą zestawów do oczyszczania.

    ■ Denaturacja szablonu nie jest kompletna —— Odpowiednio zwiększyć temperaturę denaturacji i przedłużyć czas denaturacji.

    ■ Degradacja szablonu — — Ponownie przygotuj szablon.

    Podkład A-2

    ■ Słaba jakość starterów —— Ponownie zsyntetyzuj starter.

    ■ Degradacja primera —— Rozdzielić primery o wysokim stężeniu do małej objętości w celu konserwacji. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania lub długotrwałego kriokonserwacji w temperaturze 4°C.

    ■ Niewłaściwe zaprojektowanie starterów (np. niewystarczająca długość startera, dimer utworzony między starterami itp.) - Przeprojektowanie starterów (unikaj tworzenia dimeru startera i struktury drugorzędowej)

    A-3 Mg2+stężenie

    ■ Mg2+ stężenie jest zbyt niskie ——Właściwie zwiększyć Mg2+ stężenie: Optymalizacja Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    A-4 Temperatura wyżarzania

    ■ Wysoka temperatura annealingu wpływa na wiązanie startera i matrycy. —— Zmniejsz temperaturę wyżarzania i zoptymalizuj warunki z gradientem 2°C.

    A-5 Czas przedłużenia

    ■ Krótki czas przedłużenia——Wydłużenie czasu przedłużenia.

    P: Fałszywe pozytywne

    Zjawiska: Próbki ujemne również wykazują prążki sekwencji docelowej.

    A-1 Zanieczyszczenie PCR

    ■ Zanieczyszczenie krzyżowe sekwencji docelowej lub produktów amplifikacji ——Uważaj, aby nie odpipetować próbki zawierającej sekwencję docelową w próbce ujemnej ani nie wylać jej z probówki wirówkowej. Odczynniki lub sprzęt powinny być autoklawowane w celu wyeliminowania istniejących kwasów nukleinowych, a zanieczyszczenie powinno być stwierdzone poprzez eksperymenty z kontrolą ujemną.

    ■ Zanieczyszczenie odczynnikiem —— Podziel odczynniki i przechowuj w niskiej temperaturze.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ stężenie jest zbyt niskie ——Właściwie zwiększyć Mg2+ stężenie: Optymalizacja Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    ■ Niewłaściwy projekt startera i sekwencja docelowa ma homologię z sekwencją inną niż docelowa. —— Przeprojektuj podkłady.

    P: Niespecyficzne wzmocnienie

    Zjawiska: Prążki amplifikacji PCR są niezgodne z oczekiwaną wielkością, albo duże, albo małe, lub czasami występują zarówno specyficzne prążki amplifikacji, jak i nieswoiste prążki amplifikacji.

    Podkład A-1

    ■ Słaba specyficzność startera

    —— Przeprojektuj podkład.

    ■ Stężenie podkładu jest zbyt wysokie ——Właściwie zwiększ temperaturę denaturacji i przedłuż czas denaturacji.

    A-2 Mg2+ stężenie

    ■ Mg2+ stężenie jest zbyt wysokie ——Właściwie zmniejsz stężenie Mg2+: Zoptymalizuj Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    A-3 Termostabilna polimeraza

    ■ Nadmierna ilość enzymu —— Odpowiednio zmniejsz ilość enzymu w odstępach 0,5 U.

    A-4 Temperatura wyżarzania

    ■ Temperatura wyżarzania jest zbyt niska —— Odpowiednio zwiększyć temperaturę wyżarzania lub zastosować metodę wyżarzania dwuetapowego

    A-5 cykli PCR

    ■ Za dużo cykli PCR —— Zmniejsz liczbę cykli PCR.

    P: Niejednolite lub rozmazujące się paski

    Podkład A-1——Słaba specyficzność ——Przeprojektuj starter, zmień położenie i długość startera, aby wzmocnić jego specyficzność; lub wykonaj zagnieżdżoną reakcję PCR.

    A-2 Szablon DNA

    —— Matryca nie jest czysta —— Oczyść matrycę lub wyodrębnij DNA za pomocą zestawów do oczyszczania.

    A-3 Mg2+ stężenie

    ——Mg2+ stężenie jest zbyt wysokie ——Właściwie zmniejsz Mg2+ stężenie: Optymalizacja Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    A-4 dNTP

    —— Stężenie dNTP jest zbyt wysokie —— Odpowiednio zmniejsz stężenie dNTP

    A-5 Temperatura wyżarzania

    ——Zbyt niska temperatura wyżarzania ——Odpowiednio zwiększyć temperaturę wyżarzania

    A-6 cykli

    ——Zbyt wiele cykli ——Zoptymalizuj liczbę cykli

    P: Ile matrycy DNA należy dodać w systemie reakcyjnym 50 μl PCR?
    ytry
    P: Jak wzmocnić długie fragmenty?

    Pierwszym krokiem jest wybór odpowiedniej polimerazy. Zwykła polimeraza Taq nie może dokonać korekty ze względu na brak aktywności 3'-5' egzonukleazy, a niedopasowanie znacznie zmniejszy wydajność wydłużania fragmentów. Dlatego zwykła polimeraza Taq nie może skutecznie amplifikować fragmentów docelowych większych niż 5 kb. Polimerazę Taq ze specjalną modyfikacją lub inną polimerazę o wysokiej wierności należy wybrać w celu poprawy wydajności wydłużania i zaspokojenia potrzeb amplifikacji długich fragmentów. Ponadto amplifikacja długich fragmentów wymaga również odpowiedniego dostosowania projektu startera, czasu denaturacji, czasu wydłużania, pH buforu itp. Zwykle startery o wielkości 18-24 pz mogą prowadzić do lepszej wydajności. Aby zapobiec uszkodzeniu matrycy, czas denaturacji w 94°C należy skrócić do 30 sekund lub mniej na cykl, a czas wzrostu temperatury do 94°C przed amplifikacją powinien być krótszy niż 1 min. Ponadto ustawienie temperatury wydłużania na około 68°C i zaprojektowanie czasu wydłużania na poziomie 1 kb/min może zapewnić skuteczną amplifikację długich fragmentów.

    P: Jak poprawić wierność amplifikacji PCR?

    Wskaźnik błędu amplifikacji PCR można zmniejszyć, stosując różne polimerazy DNA o wysokiej wierności. Spośród wszystkich dotychczas znalezionych polimeraz DNA Taq, enzym Pfu ma najniższy wskaźnik błędów i najwyższą wierność (patrz załączona tabela). Oprócz selekcji enzymów, naukowcy mogą jeszcze bardziej zmniejszyć szybkość mutacji PCR poprzez optymalizację warunków reakcji, w tym optymalizację składu buforu, stężenia termostabilnej polimerazy i optymalizację liczby cykli PCR.

    Napisz tutaj swoją wiadomość i wyślij ją do nas