Metylacja-specipc PCR (MSP) Kit

Zestaw do detekcji PCR specyficznej dla metylacji.

Methylation-specyfic PCR (MSP) Kit jest specjalnie opracowany dla klientów, którzy badają charakterystykę metylacji genomowego DNA metodą PCR, w której MSP DNA Polymerase jest termostabilną polimerazą zmodyfikowaną przeciwciałami, a 10×MSP PCR Buffer jest buforem PCR zoptymalizowanym specjalnie dla Reakcja MSP. Jest kompatybilny z zestawem TIANGEN DNA Bisulfite Conversion Kit (4992447).

Kot. Nie Wielkość opakowania
4992759 50 przygotowań

Szczegóły produktu

Przepływ pracy

Przykłady eksperymentalne

FAQ

Tagi produktów

Cechy

■ Produkt ma zalety szybkości, prostoty, wysokiej czułości, silnej specyficzności i dobrej stabilności.

Specyfikacja

Rodzaj: Polimeraza DNA MSP
Szablon: <500 ng
Zastosowania: Nadaje się do specyficznej dla metylacji metody PCR (MSP) do analizy charakterystyki metylacji genomowego DNA

Wszystkie produkty można dostosować do potrzeb ODM/OEM. Dla szczegółów,kliknij opcję Dostosowana usługa (ODM/OEM)


  • Poprzedni:
  • Następny:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×

    1. Methylation-Specific PCR(MSP) Kit zastosowano do amplifikacji fragmentu 400 bp przy użyciu jako matrycy genomowego DNA traktowanego wodorosiarczynem z układem reakcyjnym 20 µl.

    Experimental Exampl

    2. Ustawienie cyklu reakcji PCR

    Experimental Exampl

     

    Experimental Examples 1: Próbki przetworzone przez Dostawcę A;
    2: Próbki przetworzone przez Dostawcę B;
    3: próbka traktowana TIANGEN 4: NTC; M: D2000
    Experimental Examples 1-6:
    6 powtórzeń;
    7: Dostawca Przetworzona próbka;
    8: NTC; Bio2-F/R i P16-Me-F/R: dwa startery detekcyjne.
    P: Brak pasm wzmacniających

    Szablon A-1

    ■ Matryca zawiera zanieczyszczenia białkowe lub inhibitory Taq itp. ——Oczyść matrycę DNA, usuń zanieczyszczenia białkowe lub ekstrahuj matryce DNA za pomocą zestawów do oczyszczania.

    ■ Denaturacja szablonu nie jest kompletna —— Odpowiednio zwiększyć temperaturę denaturacji i przedłużyć czas denaturacji.

    ■ Degradacja szablonu — — Ponownie przygotuj szablon.

    Podkład A-2

    ■ Słaba jakość starterów —— Ponownie zsyntetyzuj starter.

    ■ Degradacja primera —— Rozdzielić primery o wysokim stężeniu do małej objętości w celu konserwacji. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania lub długotrwałego kriokonserwacji w temperaturze 4°C.

    ■ Niewłaściwe zaprojektowanie starterów (np. niewystarczająca długość startera, dimer utworzony między starterami itp.) - Przeprojektowanie starterów (unikaj tworzenia dimeru startera i struktury drugorzędowej)

    A-3 Mg2+stężenie

    ■ Mg2+ stężenie jest zbyt niskie ——Właściwie zwiększyć Mg2+ stężenie: Optymalizacja Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    A-4 Temperatura wyżarzania

    ■ Wysoka temperatura annealingu wpływa na wiązanie startera i matrycy. —— Zmniejsz temperaturę wyżarzania i zoptymalizuj warunki z gradientem 2°C.

    A-5 Czas przedłużenia

    ■ Krótki czas przedłużenia——Wydłużenie czasu przedłużenia.

    P: Fałszywe pozytywne

    Zjawiska: Próbki ujemne również wykazują prążki sekwencji docelowej.

    A-1 Zanieczyszczenie PCR

    ■ Zanieczyszczenie krzyżowe sekwencji docelowej lub produktów amplifikacji ——Uważaj, aby nie odpipetować próbki zawierającej sekwencję docelową w próbce ujemnej ani nie wylać jej z probówki wirówkowej. Odczynniki lub sprzęt powinny być autoklawowane w celu wyeliminowania istniejących kwasów nukleinowych, a zanieczyszczenie powinno być stwierdzone poprzez eksperymenty z kontrolą ujemną.

    ■ Zanieczyszczenie odczynnikiem —— Podziel odczynniki i przechowuj w niskiej temperaturze.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ stężenie jest zbyt niskie ——Właściwie zwiększyć Mg2+ stężenie: Optymalizacja Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    ■ Niewłaściwy projekt startera i sekwencja docelowa ma homologię z sekwencją inną niż docelowa. —— Przeprojektuj podkłady.

    P: Niespecyficzne wzmocnienie

    Zjawiska: Prążki amplifikacji PCR są niezgodne z oczekiwaną wielkością, albo duże, albo małe, lub czasami występują zarówno specyficzne prążki amplifikacji, jak i nieswoiste prążki amplifikacji.

    Podkład A-1

    ■ Słaba specyficzność startera

    —— Przeprojektuj podkład.

    ■ Stężenie podkładu jest zbyt wysokie ——Właściwie zwiększ temperaturę denaturacji i przedłuż czas denaturacji.

    A-2 Mg2+ stężenie

    ■ Mg2+ stężenie jest zbyt wysokie ——Właściwie zmniejsz stężenie Mg2+: Zoptymalizuj Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    A-3 Termostabilna polimeraza

    ■ Nadmierna ilość enzymu —— Odpowiednio zmniejsz ilość enzymu w odstępach 0,5 U.

    A-4 Temperatura wyżarzania

    ■ Temperatura wyżarzania jest zbyt niska —— Odpowiednio zwiększyć temperaturę wyżarzania lub zastosować metodę wyżarzania dwuetapowego

    A-5 cykli PCR

    ■ Za dużo cykli PCR —— Zmniejsz liczbę cykli PCR.

    P: Niejednolite lub rozmazujące się paski

    Podkład A-1——Słaba specyficzność ——Przeprojektuj starter, zmień położenie i długość startera, aby wzmocnić jego specyficzność; lub wykonaj zagnieżdżoną reakcję PCR.

    A-2 Szablon DNA

    —— Matryca nie jest czysta —— Oczyść matrycę lub wyodrębnij DNA za pomocą zestawów do oczyszczania.

    A-3 Mg2+ stężenie

    ——Mg2+ stężenie jest zbyt wysokie ——Właściwie zmniejsz Mg2+ stężenie: Optymalizacja Mg2+ stężenie poprzez serię reakcji od 1 mM do 3 mM w odstępie 0,5 mM w celu określenia optymalnego Mg2+ stężenie dla każdej matrycy i startera.

    A-4 dNTP

    —— Stężenie dNTP jest zbyt wysokie —— Odpowiednio zmniejsz stężenie dNTP

    A-5 Temperatura wyżarzania

    ——Zbyt niska temperatura wyżarzania ——Odpowiednio zwiększyć temperaturę wyżarzania

    A-6 cykli

    ——Zbyt wiele cykli ——Zoptymalizuj liczbę cykli

    P: Ile matrycy DNA należy dodać w systemie reakcyjnym 50 μl PCR?
    ytry
    P: Jak wzmocnić długie fragmenty?

    Pierwszym krokiem jest wybór odpowiedniej polimerazy. Zwykła polimeraza Taq nie może dokonać korekty ze względu na brak aktywności 3'-5' egzonukleazy, a niedopasowanie znacznie zmniejszy wydajność wydłużania fragmentów. Dlatego zwykła polimeraza Taq nie może skutecznie amplifikować fragmentów docelowych większych niż 5 kb. Polimerazę Taq ze specjalną modyfikacją lub inną polimerazę o wysokiej wierności należy wybrać w celu poprawy wydajności wydłużania i zaspokojenia potrzeb amplifikacji długich fragmentów. Ponadto amplifikacja długich fragmentów wymaga również odpowiedniego dostosowania projektu startera, czasu denaturacji, czasu wydłużania, pH buforu itp. Zwykle startery o wielkości 18-24 pz mogą prowadzić do lepszej wydajności. Aby zapobiec uszkodzeniu matrycy, czas denaturacji w 94°C należy skrócić do 30 sekund lub mniej na cykl, a czas wzrostu temperatury do 94°C przed amplifikacją powinien być krótszy niż 1 min. Ponadto ustawienie temperatury wydłużania na około 68°C i zaprojektowanie czasu wydłużania na poziomie 1 kb/min może zapewnić skuteczną amplifikację długich fragmentów.

    P: Jak poprawić wierność amplifikacji PCR?

    Wskaźnik błędu amplifikacji PCR można zmniejszyć, stosując różne polimerazy DNA o wysokiej wierności. Spośród wszystkich dotychczas znalezionych polimeraz DNA Taq, enzym Pfu ma najniższy wskaźnik błędów i najwyższą wierność (patrz załączona tabela). Oprócz selekcji enzymów, naukowcy mogą jeszcze bardziej zmniejszyć szybkość mutacji PCR poprzez optymalizację warunków reakcji, w tym optymalizację składu buforu, stężenia termostabilnej polimerazy i optymalizację liczby cykli PCR.

    Napisz tutaj swoją wiadomość i wyślij ją do nas